分子生物学实验方法

　　分子生物学（molecular biology)是从分子水平研究生物大分子的结构与功能从而阐明生命现象本质的科学。下面是小编带来的分子生物学实验方法，希望对你有帮助。

　　实验1总DNA提取

　　生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。

　　[实验目的]

　　学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。

　　[实验原理]

　　植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。CTAB是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA被释放出来。CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mMNaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。经过氯仿/异戊醇(24:1)抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。

　　由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/mlDNA溶液A260=0.020。

　　[实验器材]

　　1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料

　　[实验试剂]

　　1、3×CTABbuffer（pH8.0）

　　100mMTris

　　25mMEDTA

　　1.5MNaCl

　　3%CTAB

　　2%β-巯基乙醇

　　2、TE缓冲液（pH8.0）

　　10mmol/LTris·HCl

　　1mmol/LEDTA

　　3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）

　　4、95％乙醇

　　5、液氮

　　[实验步骤]

　　1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。

　　2、将叶片剪成1cm长，置预冷的研钵中，倒入液氮，尽快研磨成粉末。

　　3、待液氮蒸发完后，加入15mL预热（60℃）的CTAB提取缓冲液，转入一磨口锥形瓶中，

　　置于65℃水浴保温0.5h，不时地轻轻摇动混匀。

　　4、加等体积的氯仿/异戊醇，盖上瓶塞，温和摇动，使成乳状液。

　　5、将锥形瓶中的液体倒入50ml离心管中，在4℃下8000rpm离心10min。

　　6、离心管中出现3层，用滴管小心地将上层清液吸入另一干净的离心管中，弃去中间层的细胞碎片和变性蛋白以及下层的氯仿。（根据需要，上清液可用氯仿/异戊醇反复提取多次。）

　　7、收集上层清液，并将其倒入小烧杯。沿烧杯壁慢慢加入2倍体积预冷的95％乙醇。边加边用细玻棒沿同一方向搅动，可看到纤维状的沉淀（主要为DNA）迅速缠绕在玻棒上。

　　8、小心取下这些纤维状沉淀，加1～2mL70%乙醇冲洗沉淀，轻摇几分钟，除去乙醇，即为DNA粗制品。

　　9、将粗制品溶于TE缓冲液。

　　10、在分光光度计上测定该溶液在260nm/280nm紫外光波长下的光密度值。

　　[注意事项]

　　1、液氮研磨时，小心操作，以免冻伤。

　　2、所有操作均需温和，避免剧烈震荡。

　　[思考题]

　　CTAB、EDTA、巯基乙醇的作用分别是什么？

　　液氮研磨的原理是什么？

　　实验二质粒DNA的提取

　　质粒DNA是分子生物学实验中广泛应用的载体分子。质粒是细菌独立于染色体外的遗传物质，是环状的双链DNA分子。由于质粒比较小，并且能进行独立的'自我复制，常常被改造为克隆和表达的载体分子。

　　[实验目的]

　　通过本实验掌握碱裂解法提取质粒的基本原理，掌握碱裂解小量提取质粒的实验技术。

　　[实验原理]

　　碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭合环状质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速

　　而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

　　[实验器材]

　　1、恒温培养箱

　　2、恒温摇床

　　3、台式离心机

　　4、高压灭菌锅

　　5、Tip头、Eppendorg管

　　6、含有目的质粒的E.coli菌株

　　[实验试剂]

　　1、溶液I

　　50mmol/L葡萄糖

　　5mmol/L三羟甲基氨基甲烷（Tris）Tris·HCl

　　10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）

　　2、溶液II

　　0.4mol/LNaOH,2%SDS,用前等体积混合

　　3、溶液III

　　5mol/L乙酸钾60mL

　　冰乙酸11.5mL

　　水28.5mL

　　4、TE缓冲液

　　10mmol/LTris·HCl

　　1mmol/LEDTA(pH8.0)

　　5、70%乙醇（放-20℃冰箱中，用后即放回）

　　6、EcoRI及其缓冲液

　　7、HindIII及其缓冲液

　　[实验步骤]

　　1、将含有目的质粒的E.coli菌株接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜。

　　2、取1ml培养物倒入Eppendorf管中，12000r/min离心30sec。

　　3、吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

　　4、将细菌沉淀悬浮于100μL冰预冷的溶液I中，剧烈振荡。

　　5、加200μL溶液II（新鲜配制），盖紧管皿，快速颠倒5次，混匀内容物，将Eppendorf管放在冰上。

　　6、加入150μL溶液III（冰上预冷），盖紧管口，颠倒数次使混匀，冰上放置5min。7、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

　　8、向上清液加入等体积的饱和酚，混匀。

　　9、12000r/min，离心5min，将上清液转至另一Eppendorf管中。

　　10、向上清液加入2倍体积乙醇，混匀后，室温放置5~10min。12000r/min离心5min。倒去上清液，把Eppendorf管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

　　11、1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。12、20μLTE缓冲液，使DNA完全溶解，-20℃保存。

　　[注意事项]

　　操作时，避免剧烈震荡。

　　[思考题]

　　1、实验操作中，饱和酚的作用是什么？

　　2、SDS和NaOH的作用是什么？

　　[参考文献]

　　《精编分子生物学实验指南》（第四版）

　　[美]FM奥斯伯，RE金斯顿等主编科学出版社2005

　　实验三总RNA提取　　

　　1．掌握样品中总RNA的提取的原理和方法。

　　2．熟悉RNA纯度及浓度检测方法。

　　3．了解RNA提取过程中的注意事项。

　　RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性，并有助于除去非核酸成分。

　　1．总RNA提取的基本原理和常用方法介绍

　　2．进行动物组织或血液样品总RNA提取。

　　3．对提取的RNA的进行纯度和浓度检测。

　　超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管。

　　玻璃器皿洗净后置180℃烘烤8h；不耐高温的器皿（如塑料制品）应用0.1%DEPC浸泡2h,70～80℃烘烤干燥，120℃高压20min，再70～80℃烘烤干燥方可使用。

　　细胞裂解液：异硫氰酸胍4mol/L；柠檬酸钠（pH7.0）25mmol/L；十二烷基肌氨酸钠0.5%；β-巯基乙醇0.1mol/L（称取柠檬酸钠0.64g，十二烷基肌氨酸钠0.415g，吸取β-巯基乙醇0.7ml，用无Rnase的蒸馏水溶解，定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml，异硫氰酸胍25g,混合，完全溶解后4℃保存备用）

　　TRIzolRNA抽提试剂、2mol醋酸钠、0.1%DEPC、平衡酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、氯仿、无水乙醇、异丙醇、75%乙醇（用RNase-free水配制）、RNase-free的水。

　　（一）异硫氰酸胍法（PLT）

　　1．取新鲜动物组织0.1～0.2g置于组织匀浆器中，加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴

　　中迅速匀浆15～30s，以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。

　　2．加入2mol醋酸钠（pH4.0）120μl，充分混匀。

　　3．加入1.2ml酚：氯仿：异戊醇，充分混匀摇振10s，冰浴15min。

　　4．将混合物转移至1.5mlEp管中，4℃，离心10000r/min,20min.

　　5．移取上层水相至另一Ep管中，加入等体积的异丙醇，静置-20℃，30min沉淀RNA.

　　6．4℃，离心12000r/min，15min.

　　7．弃上清液，加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物；如果RNA沉淀物被悬浮，则4℃离心10000r/min，10min。

　　8．弃上清液，自然干燥，但应避免沉淀完全干燥，否则RNA难以溶解。

　　9．加入100μl无RNase水重悬RNA，或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠（pH4.0），-70℃保存。

　　（二）TrizolReagent/总RNA提取试剂

　　TRIzol是从细胞和组织中提取总RNA的即用型试剂，在样品裂解或匀浆过程中，TRIzol能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相，用异丙醇可沉淀回收RNA。下面介绍由上海美季生物技术有限公司总RNA提取试剂推荐的操作步骤：

　　1.匀浆处理（Homogenization）

　　（1）组织中提取总RNA

　　①植物组织：植物叶片直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100mg植物叶片加入1mlTRIzol。

　　②动物组织：按10-30mg组织加入1mlTRIzol，用电动匀浆器或者一次性研磨杵充分匀浆。

　　（2）培养细胞中提取总RNA

　　①贴壁细胞：无须胰酶消化，可直接用TRIzol进行裂解，每10平方厘米培养面积加1mlTRIzol。

　　②悬浮细胞：可直接离心收集、裂解，每1mlTRIzol可裂解5×106动物或酵母细胞，或107细菌细胞。

　　（3）血液中提取总RNA

　　直接取新鲜的血液，加入3倍体积红细胞裂解液，混匀后室温放置10分钟，10,000rpm离心1分钟。彻底吸弃上清，收集白细胞沉淀。每100-200μl血液收集的白细胞沉淀加入1mlTRIzol。

　　2．分层（PhaseSeparation）

　　（1）样品加入TRIzol后，室温放置5min，使样品充分裂解。

　　注：如不进行下一步操作，样品可放入-70℃长期保存。